尽管在基因组测序方面取得了进展，但一些遗传变异仍被归类为不确定意义变异（VUS），使疾病的诊断和治疗复杂化。这在非小细胞肺癌（NSCLC）相关的 EGFR 变异中尤其明显，其中约 50% 的 EGFR 变异是 VUS。目前的治疗方法，包括靶向 EGFR 的酪氨酸激酶抑制剂（TKIs），对非典型突变的效果较差，导致预后不佳和耐药。新的方法，如多重检测和基于聚类、定期间隔的短回文重复（CRISPR）的筛选，有助于评估变异，但它们目前缺乏分析所有可能突变所需的规模、特异性和准确性。

碱基编辑技术提高了准确性，但受到意外编辑和限制性突变类型的限制。Prime 编辑是一种更先进的方法，可以精确地引入多种突变，包括插入和删除，为评估 VUS 的致病性提供了一种高通量方法，并为个性化癌症治疗开辟了新的途径。在本研究中，研究人员使用碱基和引物编辑的组合对 EGFR 基因的整个编码序列进行高分辨率突变扫描，以鉴定与各种细胞类型的癌症进展和耐药性相关的已知和新的突变。

研究人员利用依赖于野生型 EGFR 生长的 MCF10A 细胞来评估 EGFR 变异的致病性。他们在 EGFR 中引入了特异性突变，通过慢病毒传递，使用胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器（BE3.9max 和 ABE8e）促进激活，使用 1,496 个单导核糖核酸（sgRNAs）库靶向所有 EGFR 外显子和关键调控位点。在编辑和剥夺 EGF 之后，研究人员对 sgRNAs 进行测序，以鉴定影响细胞活力的突变。在后续筛选中，他们通过用吉非替尼或奥西替尼治疗 MCF10A 细胞，并分析 sgRNA 文库以识别新的耐药变体，评估了与耐药相关的 EGFR 突变。

为了扩大他们的突变筛选，研究人员还使用了启动编辑来引入更广泛的 EGFR 突变，包括来自 ClinVar 和 COSMIC 数据库的突变。他们设计了没有 MLH1 基因的 MCF10A 细胞，以提高引物编辑效率，并通过慢病毒载体传递了针对 14 个已知和重要的 EGFR 突变的引物编辑指导 RNAs（pegRNAs）。在 pegRNAs 中包含同义突变使研究人员能够检查它们对编辑效率的影响。

在 MCF10A 细胞中，这两种碱基编辑器的编辑效率都达到了 95-97%，随着时间的推移，突变会积累，一些等位基因会出现多次编辑。筛选发现了基本 sgRNAs 的缺失，证实了筛选检测损害细胞活力的突变的能力。值得注意的是，EGFR 中影响剪接位点的突变、无义突变和错义突变与功能丧失效应相关。

筛选显示已知的和几种新的 EGFR 突变与耐药性有关，特别是在 EGFR 酪氨酸激酶结构域的 ATP 连接口袋中。对于吉非替尼，已知的突变如 Thr790Met，以及先前未表征的结合袋附近突变，包括 Val726、Met766 和 Thr854，被证实具有耐药性。对于奥西替尼，Thr790Ala、Gln791Arg 和 Val845Ala 等突变以及 C 端结构域突变富集，提示不同的耐药机制。这些发现强调了 EGFR 中特定的分子内相互作用和结构变化有助于抵抗各种 TKIs。

碱基编辑还揭示了影响药物敏感性的突变的微妙观点。例如，Val845Ala 突变对奥西替尼耐药，但对吉非替尼敏感，而其他突变，如 Lys852Glu，对两种药物都有耐药性。继发性突变，如 Thr790Met，进一步增强了 EGFR 突变 PC-9 细胞的耐药性。引体编辑引入了 ClinVar 和 COSMIC 中列出的近 92% 的 EGFR 变异，确定了新的突变，包括外显子 20 插入和与耐药性相关的细胞外结构域突变。

该研究证明了多模态精确碱基和引物编辑的优势，并为 EGFR 激活和耐药性提供了见解。然而，它依赖于 EGF 独立增殖作为 EGFR 信号的代理，并且没有分析受体相互作用或杂合效应，因此受到限制。未来的研究可以利用额外的细胞模型和工程细胞系来解决这些问题。

总之，本研究开发了一个强大的，高分辨率的突变扫描框架，结合了碱基和起始编辑的能力来分析与耐药性和肿瘤生长有关的基因变异。将这种方法扩大到更广泛的遗传元素和细胞模型，包括原代人类细胞，将有助于阐明各种遗传变异的临床相关性，并支持个性化的癌症治疗。