自 1996 年高致病性 H5N1 禽流感（HPAI）出现以来，其在各大洲的传播导致了不同的进化支和重大的跨物种感染。2021 年末，进化枝 2.3.4.4b 出现在北美，感染了鸟类、哺乳动物和人类。

到 2024 年，美国奶牛场暴发了首例人类牛 H5N1 感染病例，引起了对物种间传播的担忧。

遗传分析揭示了潜在的 HA 受体结合适应促进人类感染，尽管没有人传人的报道。受体结合转变的历史证据突出了大流行的风险，因此有必要在全球范围内进一步研究 H5N1 的进化。

从全球流感数据共享计划（GISAID）获得甲型流感/得克萨斯/37/2024 H5N1 病毒 HA 外结构域序列，并将其亚克隆到含有分泌信号肽、三聚体结构域、凝血酶位点和 his 标签的 pfastbac1 载体中。

利用 Bac-to-Bac 系统在 Sf9 细胞中生成重组杆状病毒。可溶性 HA 在 High Five 细胞中表达，MOI 为 5-10。该蛋白通过金属亲和层析和尺寸排除层析纯化，然后用胰蛋白酶消化，用于结构研究和结合分析。

结晶利用坐滴蒸汽扩散，优化了载血凝素和突变型血凝素的结晶条件。将晶体用禽类（Neu5Acα2-3Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc (LSTa)）或人（Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc (LSTc)）受体类似物浸泡。

在同步加速器设备上收集的衍射数据通过分子置换进行求解，并用 PHENIX 进行细化。使用表面等离子体共振（SPR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和聚糖微阵列来评估受体特异性。

合成代表鸟类和人类受体的生物素化聚糖进行分析，并使用 Biacore 软件计算结合亲和力。

SPR、ELISA 和聚糖阵列分析表明，野生型（WT）牛 Texas H5 HA 在结合实验中表现出强烈的禽类受体偏好。

WT HA 与 α2-3 唾液皂苷（鸟型受体）结合强烈，解离常数（K_D）为 138 nM，但与 α2-6 唾液皂苷（人型受体）无明显结合。这些结果在所有方法中都是一致的，证实了德克萨斯州 H5 HA 的鸟型特异性。

德克萨斯 H5 HA 受体结合位点（RBS）的 Gln226Leu 突变导致特异性从 α2-3 到 α2-6 的完全转换，反映了对人类受体偏好的转变。与线性突变体相比，Gln226Leu 突变体与双触角 α2-6 皂苷的结合更强。此外，该突变体对 α2-6 唾液苷的亲和力高于 2009 年 H1N1 大流行毒株的 HA，这表明其对人型受体的特异性增强。

结构分析表明，Gln226Leu 突变定位亮氨酸与 α2-6 受体形成范德瓦尔斯相互作用，为特异性转换提供了分子基础。

进一步引入突变来探讨它们对受体结合的影响。在 Gln226Leu 突变体中添加 Gly228Ser，模仿人类 H2 和 H3 病毒的适应性，与 Gln226Leu 突变体相比，没有显著改变受体特异性。

突变，如 Gly225Asp 和 Glu190Asp，是 H1 人类受体结合转变的标志残基，未能在德克萨斯州 H5 HA 中诱导类似的开关。

Asn224Lys 与 Gln226Leu 的结合进一步增强了与 α2-6 唾液酸苷的结合，特别是延伸和双天线形式，而与 α2-3 唾液酸苷的结合仅为弱结合。

然而，其他突变，包括靶向位置 193 和 227 的突变，当与 Gln226Leu 结合时，并没有显著改善人受体的结合。值得注意的是，这些突变体通常保留了与双链聚糖的强结合。

德克萨斯 H5 HA 与禽类和人类受体类似物复合物的晶体结构为受体特异性的分子相互作用提供了详细的见解。具有 LSTa 的 WT HA 复合物与 Gln226 形成氢键，这对鸟类受体偏好至关重要。

相比之下，与 LSTc 的 Leu226 突变体复合物显示出改变的相互作用，包括 Asn193 和 Lys156 介导的新接触，与它对人型受体的特异性一致。

总之，H5N1 禽流感病毒严重影响家禽生产，并通过人类和哺乳动物的散发感染构成大流行威胁。自 2021 年以来，2.3.4.4b 进化支 H5 病毒广泛传播，感染了野生鸟类、家禽、奶牛和包括人类在内的各种哺乳动物。

尽管牛 H5 HA 具有鸟型受体特异性，但一项研究表明，单个基因组 Gln226Leu 突变可以改变受体与人型受体的结合。

这种结合力虽然较弱，但反映了一些传染性人类流感病毒的亲和力，例如 2009 年 H1N1 大流行毒株。其他的突变，如 Asn224Lys，增强了与人类受体的结合，引起了对人畜共患病适应的担忧。